Étude des mécanismes de résistance d'une bactérie entomopathogène aux peptides antimicrobiens de son hôte
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Dans le but de limiter l'utilisation de pesticides dans les cultures, les nématodes (vers microscopiques) s'avèrent être des outils de lutte biologique efficaces contre certains insectes nuisibles, par leur capacité à libérer dans l'hémolymphe (plasma de l'insecte) des bactéries entomopathogènes telles que Photorhabdus luminescens. Or, en réponse à l'infection, certains insectes produisent des peptides antimicrobiens (PAMs) actifs sur ces bactéries.
L'espèce Photorhabdus luminescens (P. luminescens) a développé des stratégies qui lui permettent de résister à ces peptides antimicrobiens (PAMs), dont la pompe à efflux MdtABC, pour « Multidrug Transporter ABC », codée par l'opéron mdtABC.
Caractérisation de l'opéron mdtABC de P. luminescens⚓
L'analyse informatique des séquences génomiques de P. luminescens permettant la caractérisation du locus mdtABC est présentée dans le document 1. Chez E. coli, le locus mdtABC correspond à un opéron codant les protéines constitutives de la pompe à efflux MdtABC.
Document 1 - Caractérisation du locus mdtABC chez P. luminescens
Analysis of the P. luminescens TT01 genome sequence revealed the presence of a mdt locus containing three open reading frames, mdtA, mdtB and mdtC.
The mdtA gene encodes a 401-amino acid putative membrane protein 70 % identical to the MdtA protein of E. coli (E-value of 1e-166). Both mdtB and mdtC genes encode transporter proteins MdtB and MdtC and are 78 % (E-value of 0,0) and 76 % (E-value of 0,0) identical to MdtB and MdtC of E. coli, respectively.
According to Joshi and Xu (2007), if two proteins have more than 70 % of sequence identity, they have about 90 % probability or more to share the same biological process.
Démarche scientifique
Logiciels utilisés
ORF
Définition
E-value
Question⚓
Préciser l'intérêt de déterminer l'E-value lors d'un alignement de séquences.
Solution⚓
Lorsqu'on fait une comparaison de séquence avec un logiciel type BLAST, on obtient des alignements caractérisés par un score et une e-value. la e-value correspond à l'espérance mathématique (= probabilité que le score soit du au hasard). Plus elle est faible, plus on est assuré que les similitudes ne sont pas due au hasard.
Rôle des protéines
Question⚓
Argumenter le rôle attribué aux protéines codées par le locus mdtABC chez P. luminescens.
Solution⚓
On considère que s'il y a plus de 70% d'homologies entre 2 séquence protéiques, alors les protéines ont au moins 90% de chances d'avoir la même fonction.
Ici, on obtient plus de 76% d'homologie, on en déduit que les protéines codées par l'opéron mdtABC de P.luminescens partagent la même fonction que celles de l'opéron mdtABC de E.coli, c'est-à-dire qu'elles sont des constituants de la pompe à efflux MdtABC, d'autant plus qu'elles ont une e-value faible (0,0).
Opéron
Question⚓
Proposer une définition pour le terme « opéron ».
Solution⚓
Un opéron est un ensemble de séquences codantes adjacentes (souvent impliquées dans la même fonction) placées sous le contrôle d'un même promoteur et donc dont l'expression est soumise aux mêmes régulations.
C'est bien compliqué tout ça...
Si vous avez trop de mal, vous pouvez vous aider d'une version Quiz de cette partie. Rappelez-vous toutefois que vous n'en aurez pas à l'examen. Vous avez donc tout intérêt à commencer par chercher les informations dans vos cours, ce sera plus profitable...
Production d'une souche de P. luminescens mutée sur mdtA⚓
Pour caractériser l'implication de la pompe à efflux mdtABC dans la résistance aux PAMs, les chercheurs ont réalisé la construction d'un mutant stable de P. luminescens : P. luminescens ΔmdtA.
L'expérimentation débute par l'extraction de l'ADN génomique de P. luminescens par la méthode au phénol chloroforme en présence de RNases.
Rôle des constituants
Question⚓
Indiquer le rôle des trois composés en gras ci-dessus (phénol, chloroforme, RNases), utilisés pour l'extraction de l'ADN génomique de P. luminescens.
Le mutant P. luminescens ΔmdtA a été obtenu par échange allélique mettant en jeu une recombinaison homologue. Les étapes de la construction du vecteur utilisé pour cet échange sont présentées dans le document 2A.
Étape 1
Question⚓
Schématiser les deux amplicons produits à l'issue de l'étape 1, mdtA5' et mdtA3', en indiquant pour chacun les différents sites de restriction mis en jeu.
Solution⚓
La première étape est une PCR utilisant des amorces dégénérées, c'est-à-dire qu'elles ajoutent des sites de restriction à la séquence du gène. On obtiendra donc 2 amplicons encadrés chacun par 2 sites de restriction :
mdtA5' | mdtA3' | |
amorce sens | XbaI | BamHI |
amorce antisens | BamHI | SacI |
On obtient donc les amplicons suivants à l'issue de la PCR :
Document 2B
Les produits de PCR mdtA5' et mdtA3' sont digérés avec les enzymes XbaI/BamHI et BamHI/SacI respectivement. La cassette de résistance à l'antibiotique chloramphénicol, Ωcm (3.5 kb), a été isolée à partir d'un autre plasmide, par digestion avec l'enzyme BamHI. Ce fragment est ensuite ligaturé dans les sites BamHI, entre les produits de PCR mdtA5' et mdtA3'.
Étape 2
Question⚓
Schématiser la cassette mdtA5'-ΩCm-mdtA3' obtenue à l'issue de l'étape 2 en indiquant sa taille approximative et les sites de restriction.
Solution⚓
A l'issue de la PCR, on obtient :
On a la cassette chloramphénicol encadrée par les sites BamHI
Si on digère chaque fragment par les enzymes de restriction correspondantes (XbaI/BamHI/SacI), qu'on le purifie (électrophorèse préparative) puis qu'on effectue une ligature, le fragment ΩCM s'insère entre les sites BamHI des amorces. Sa taille approximative correspond à 3,5 + 0,7 + 0,6 = 4,8 kb.
En fait, comme la cassette chloramphénicol est encadrée par les 2 mêmes sites de restriction, on peut aussi avoir
religature des produits de PCR sur eux-mêmes
inversion de la cassette chloramphénicol
Document 2C
Le fragment d'ADN obtenu, mdtA5'-ΩCm-mdtA3', est ensuite purifié sur gel, puis digéré avec les enzymes appropriées et enfin inséré aux sites de restriction correspondant du vecteur pJQ200SK. La construction obtenue est notée pJQ-mdtA-ΩCm.
Cm : Chloramphénicol.
MCS : Multiple cloning site
p15A ori : plasmid containing the p15A origin of replication can be propagated in E.coli cells that contain a second plasmid with ColE1 origin.
GmR : confers resistance to gentamycin
Ori T : origin of tranfer
Intégration de la cassette dans le vecteur
Le vecteur recombiné, nommé pJQ-mdtA-ΩCm, est utilisé pour transformer une souche d'E.coli.
Technique de transformation bactérienne
Question⚓
Nommer une technique de transformation bactérienne et en exposer le principe.
Solution⚓
Il existe plusieurs méthodes de transformation bactérienne.
La plus fréquente est une méthode chimique qui utilise un choc thermique appliqué sur des bactéries compétentes à froid en présence de CaCl2.
Le froid rigidifie (donc fragilise la membrane plasmique), les ions CA2+ déstabilisent la membrane et vont permettre de neutraliser les charges négatives de l'ADn et de la membrane plasmique afin de faciliter la pénétration du plasmide dans la bactérie.
Le choc thermique (1 à 2 minutes à 42-45°C) permet la création de pores transitoires permettant la pénétration du plasmide dans la bactérie.
L'électroporation est une autre technique utilisable pour la transformation des bactéries : l'application d'un champ électrique bref et intense permet la création de pores transitoires dans la membrane et la pénétration du plasmide.
Remarque : la transduction (utilisation d'un bactériophage comme vecteur) peut aussi être utilisée, mais on ne parle plus de transformation
Recombinaison homologue
Le vecteur pJQ-mdtA-ΩCm est ensuite transféré de la souche d'E. coli à une souche de P. luminescens par conjugaison.
Un échange allélique par recombinaison homologue peut alors avoir lieu entre la séquence du gène mdtA présente dans le génome de P. luminescens et les séquences mdtA5' et mdtA3' du vecteur pJQ-mdtA-ΩCm.
Résultat de la recombinaison homologue
Nom du mutant
Phénotype du mutant
Question⚓
Indiquer la conséquence de la recombinaison sur le phénotype de la souche P. luminescens ΔmdtA et en déduire le composé à ajouter au milieu de culture en vue de sélectionner ces colonies.
Afin de vérifier que les colonies d'intérêt sont bien porteuses de la mutation attendue, les chercheurs quantifient l'expression de mdtA chez ces dernières par RT-qPCR après extraction des ARN totaux.
Quantification des ARN totaux
Question⚓
Citer une technique qui permet de vérifier la qualité d'extraits d'ARN totaux et une technique qui permet de vérifier la concentration des extraits à utiliser pour la transcription inverse.
L'étape de transcription inverse utilise des amorces de type « random hexamers ».
Amorces "random hexamers"
Question⚓
Expliquer le rôle de ces amorces.
Solution⚓
Il s'agit d'un ensemble d'hexamères de séquences aléatoires qui vont donc se fixer de manière aléatoire sur les ARN afin de servir d'amorce pour la synthèse du premier brin d'ADNc.
Le nombre de séquences de 6 nucléotides possibles est 46 (=4096). On ajoute donc dans le milieu toutes les combinaisons possibles. Pour chaque séquence d'ARNm on pourra donc trouver l'hexamère complémentaire. Ainsi, la totalité des ARNm pourra être rétro-transcrite.
Il existe d'autres types d'amorces pour la synthèse d'un ADNc
NB : le poly-T n'aurait aucun intérêt ici puisqu'il s'agit d'ARNm bactériens, qui ne possèdent donc pas la queue poly-A
Suite à la transcription inverse, les ADNc simple brin sont amplifiés par PCR en présence de Sybr®Green et d'amorces spécifiques. L'amplification est suivie en temps réel dans un thermocycleur comportant un module fluorimétrique.
Vérification de la spécificité
Question⚓
Préciser comment la spécificité de l'amplification peut être vérifiée en PCR quantitative utilisant du Sybr®Green.
Solution⚓
Le SybrGreen se lie de manière non spécifique à l'ADN double brin. Il y aura donc émission de fluorescence même si l'amplification n'est pas spécifique.
On réalise alors une courbe de fusion (en fait sa dérivée afin d'obtenir un pic, plus lisible qu'un point d'inflexion) en faisant varier la température par palier afin de déterminer la Tm.
La Tm dépendant de la teneur en GC d'une part et de la longueur de l'amplicon d'autre part, elle est spécifique à chaque amplicon. Si on observe 2 pics, c'est qu'il y a eu amplification non spécifique.
Résultats attendus pour les souches sauvages et mutantes
Question⚓
Représenter sur un même graphique l'allure des courbes attendues pour les souches de P. luminescens sauvage et mutante ΔmdtA (gène mdtA non transcrit).
Positionner le cycle seuil (Ct) pour chaque courbe.
Solution⚓
On utilise des amorces spécifiques de mdtA (probablement dans la partie centrale du gène). Pour la souche sauvage, le gène est exprimé normalement. Par contre, pour la souche mutante, le gène n'est pas exprimé. La courbe ne va donc pas dépasser le cycle seuil (ou très tardivement donc Ct très grand).
C'est toujours bien compliqué tout ça...
Si vous avez encore trop de mal, voici version Quiz de cette partie. Mais ce n'est toujours pas la meilleure idée...
Étude de l'expression de l'opéron mdtABC et de son rôle dans la pathogénicité de P. luminescens⚓
Afin de déterminer les conditions d'expression de l'opéron mdtABC, la séquence codant la GFP (green fluorescent protein) a été placée soit sous le contrôle du promoteur de l'opéron mdtABC (pmdtA-gfp), soit sous le contrôle d'un promoteur lac constitutif (plac-gfp) dans deux souches de P. luminescens.
Ces deux souches sont ensuite utilisées pour étudier l'activité du promoteur mdtA :
in vivo par l'infection de larves du criquet migrateur Locusta migratoria par P. luminescens
in vitro par l'ajout d'extraits tissulaires d'insectes à des cultures de P. luminescens
Intérêt de la GFP in vivo
Question⚓
Préciser les intérêts de l'utilisation de la GFP dans les expériences in vivo.
Promoteur constitutif
Rôle de plac-gfp
Question⚓
Déduire un rôle de la souche de P. luminescens porteuse de plac-gfp dans l'analyse de ces expériences.
Les protocoles et résultats sont présentés dans les documents 3 et 4.
Document 3 - Comparaison de l'expression in vivo de l'opéron mdtABC et d'une GFP constitutive chez P.luminescens dans les larves de Locusta migratoria
Document 3a - Expression dans l'hémolymphe de Locusta migratoria
Les larves de L. migratoria sont infectées avec P. luminescens porteuse de la fusion transcriptionnelle plac-gfp (B) ou pmdtA-gfp (D). De l'hémolymphe est régulièrement prélevée durant l'infection et puis observée au microscope à fluorescence (B et D).
Les observations montrées ont été réalisées 30 heures après infection des larves.
Aide à la lecture
Document 3b - Expression dans l'organe hématopoïétique de Locusta migratoria
Les larves de L. migratoria sont infectées avec P. luminescens porteuse de la fusion transcriptionnelle plac-gfp ou pmdtA-gfp. Les tissus de l'organe hématopoïétique sont observés en fluorescence.
Les observations montrées ont été réalisées 30 heures après infection des larves.
Analyse du document 3
Question⚓
Analyser les résultats présentés dans le document 3.
Conclure quant à l'activité du promoteur pmdtA.
Document 4 - Niveau d'expression in vitro de l'opéron mdtABC de P. luminescens dans le plasma de Locusta migratoria et dans un milieu contenant des extraits d'organe hématopoïétique (HO)
Des cultures de 24 heures de souches de P. luminescens porteuses de la construction pmdtA-gfp sont diluées dans des plaques 96 puits contenant un des milieux suivants : milieu LB (LB), plasma de criquet (hémolymphe dépourvue de cellules : Locust plasma) ou milieu LB supplémenté avec de l'extrait d'organe hématopoïétique (HO extracts). L'absorbance à 600 nm et la fluorescence de la GFP sont mesurées en temps réel. RFU correspond au Ratio de Fluorescence spécifique. L'astérisque indique un résultat significatif.
Analyse du document 4
Question⚓
Montrer que les résultats présentés dans le document 4 confortent la conclusion de l'analyse du document 3.
Solution⚓
Le milieu LB correspond à un expression de référence pour le promoteur mdtA en l'absence d'élément de régulation. On observe un log10RFU = 0,12.
En présence d'hémolymphe, le log10RFU n'est plus que de 0,03 ; la fluorescence due à la GFP sous contrôle de PmdtA a donc diminué. L'expression est 4 fois moins importante que dans le milieu LB de référence
En présence d'extrait d'organe hématopoïétique, log10RFU = 1,5.
L'expression est 10 fois plus importante que dans le milieu LB de référence légèrement supérieure à la fluorescence sous contrôle de plac)
On en déduit que le promoteur mdtA est inhibé dans l'hémolymphe et activé dans l'organe hématopoïétique, ce qui confirme les conclusions précédentes.
Mécanisme d'activation possible
Toujours compliqué ?
Vous avez pris l'habitude des quiz ? Vous en voulez un autre pour cette partie aussi ?
Dommage, je n'ai pas eu le temps de le faire !
(en fait si)