Pour extraire et purifier l'ADN génomique d'une bactérie, on peut utiliser le kit NucleoBond AXG 20 de Macherey-Nagel.
Composition des tampons⚓
On nous donne les compositions des différents tampons utilisés dans le kit. On va chercher à comprendre le rôle de ces tampons en analysant leurs constituants.
Tampon G3
EDTA
Préciser le rôle de l'EDTA
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Tween 20
Préciser le rôle du Tween 20
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Triton X-100
Préciser le rôle du Triton X-100
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Rôle du tampon G3
Quel pourrait être le rôle du tampon G3 ?
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Les détergents permettent de solubiliser les lipides. Il y a donc altération des membranes. L'ADN bactérien, libéré dans l'environnement est protégé de la dégradation par l'EDTA.
Tampon G4
Préciser le rôle du Chlorure de Guanidinium (GuCHl)
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Tampons N
Préciser le rôle du KCl
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Les ions permettent de neutraliser les charges de l'ADN et facilitent ainsi son interaction avec la colonne
Etape 1⚓
La première étape du protocole se déroule de la façon suivante :
RNase A
Préciser le rôle de la RNase A ajoutée au tampon G3.
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Protéinase K
Préciser le rôle de la Protéinase K ajoutée au tampon G3.
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Lysozyme
Préciser le rôle du lysozyme qui peut être ajouté au tampon G3.
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Rôle de l'incubation à 37°C
Indiquer le rôle de l'incubation à 37°C pendant 20 minutes
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A 37°C pendant 20 minutes, les enzymes (RNase A, Protéinase K et Lysozyme) vont pouvoir exercer leur action dans des conditions optimales.
Rôle de l'incubation à 50°C
Indiquer le rôle de l'incubation à 50°C pendant 30 minutes
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Une fois que les enzymes ont agit, elles sont devenues inutiles ; les enzymes sont des protéines. Quand on chauffe, les protéines vont se dénaturer de façon irréversible (pensez à la cuisson des blancs d’œufs) et seront inactivées.
Rôle de l'étape 1
Indiquer à quoi correspond l'étape 1 de ce protocole
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Étape 2⚓
La deuxième étape du protocole se déroule de la façon suivante :
Rôle de l'étape 2
Indiquer à quoi correspond l'étape 2 de ce protocole
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Intérêt de l'étape 2
Pourquoi cette étape est-elle nécessaire ?
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On ajoute à la colonne le tampon N2 qui servira ensuite lors de l'étape d'adsorption. Ainsi, l'ADN et la colonne se trouvent dans les mêmes conditions, favorables à l'adsorption.
Étape 3⚓
La troisième étape du protocole se déroule de la façon suivante :
Rôle de l'étape 3
Indiquer à quoi correspond l'étape 3 de ce protocole
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Rôle de l'éthanol
Pourquoi ajoute-t-on de l'éthanol dans le tampon
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L'éthanol est un solvant apolaire alors que l'ADN est une molécule très polaire. L'ADN n'a donc aucune affinité pour l'éthanol. Il va donc se fixer sur la colonne plutôt que de rester en solution en présence d'éthanol.
Étape 4⚓
La quatrième étape du protocole se déroule de la façon suivante :
Rôle de l'étape 4
Indiquer à quoi correspond l'étape 4 de ce protocole
Votre choixChoix attenduRéponse
On lave toujours en présence d'éthanol ; cela permet maintenir l'ADN fixé sur la colonne car il a peu d'affinité pour l'éthanol.
Étape 5⚓
La cinquième étape du protocole se déroule de la façon suivante :
Rôle de l'étape 5
Indiquer à quoi correspond l'étape 5 de ce protocole
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Facteur déclenchant
Parmi les constituants du tampon utilisé, quel est celui responsable de l'effet identifié à la question précédente ?
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La force ionique (KCl) est intermédiaire entre celle du tampon N2 et celle du tampon N3 qui favorisent la fixation de l'ADN à la colonne. Ce n'est donc pas elle qui est responsable du décrochage de l'ADN.
Le Tris et l'éthanol sont identiques dans les 3 tampons (on aurait pu s'attendre à une diminution de la concentration en éthanol dans ce tampon d'élution, mais ce n'est pas le cas ici).
Le seul paramètre qui varie de façon significative est le pH qui est passé de légèrement acide (6,3) à légèrement alcalin (8,5).
Document complémentaire
Le protocole complet du kit présente cette figure :
A partir de l'analyse de cette figure, Expliquer comment doit évoluer la concentration en sel pour l'élution si le pH augmente ?
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On observe que les courbes sont décroissante. Si le pH augmente, la concentration en sel doit être abaissée pour permettre l'élution.
Étape 6⚓
La dernière étape du protocole se déroule de la façon suivante :
Rôle de l'étape 6
Indiquer à quoi correspond l'étape 6 de ce protocole
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L'isopropanol, comme l'éthanol est un solvant apolaire dans lequel l'ADN n'a pas d'affinité. Il va donc précipiter et sera ainsi concentré au fond du tube après centrifugation et élimination du surnageant.
Remarque : L'isopropanol est utilisé pour précipiter les gros fragments d'ADN (ce qui est le cas ici puisqu'on veut extraire l'ADN génomique). Pour les petits fragments, on préférera l'éthanol)
Intérêt de l'étape
Quel est l'intérêt de cette dernière étape ?
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Principe⚓
Quel est le principe de purification utilisé dans ce kit ?
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