Introduction
Thermostabilité
Processivité et vitesse
Fidélité
Spécificité
Fin
Propriétés des ADN polymérases
Comment définit-on rigoureusement la thermostabilité ?
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Définition
Cause
Quel paramètre conditionne la processivité d'une ADN polymérase ?
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Plus la polymérase va avoir d'affinité pour l'ADN, plus elle va y rester liée et donc plus elle pourra ajouter de nucléotides (= plus elle sera processive)
Implication
Quelle propriété de l'ADN polymérase dépend directement de sa processivité ?
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Application
Pour synthétiser un grand fragment d'ADN, on va utiliser
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Pour synthétiser de longs fragments, il est utile d'utiliser une polymérase qui allongera une grande portion d'ADN avant de se décrocher (même si en pratique au lycée, on utilise la moins chère quelle que soit la PCR !!)
Propriété de l'ADN polymérase
Quelle propriété de l'ADN polymérase lui permet d'augmenter la fidélité de la PCR ?
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L'activité exonucléase 3'-5' permet à l'ADN polymérase d'effectuer une "relecture" afin d'éliminer les mauvais appariements.
Application
Pour une PCR de routine au laboratoire on utilise
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En routine, la PCR sert surtout à vérifier la qualité d'une préparation. Le fragment amplifié n'est pas réutilisé par la suite. Une ou plusieurs erreurs dans la séquence seront sans importance. On utilise donc la polymérase la moins coûteuse
Spécificité et PCR
Comment se traduit un manque de spécificité de la PCR sur un gel d'électrophorèse ?
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Normalement, un jeu d'amorce doit amplifier un seul segment d'ADN. On ne doit donc retrouver sur le gel d'électrophorèse qu'une seule bande correspondant à l'amplicon recherché.
Hypothèse ?
Quelle pourrait être la cause d'un manque de spécificité de la PCR ?
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Spécificité et température
Dans quelle condition de température d'hybridation la spécificité est-elle la meilleure ?
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La spécificité correspond à une hybridation non spécifique des amorces. Si toutes les bases ne sont pas appariées, alors l'interaction est assez fragile et ne résistera pas à des températures élevées. On a donc une meilleure spécificité pour une température d'hybridation élevée (mais une moins bonne efficacité !)
Solution
Afin d'augmenter la spécificité de la PCR, les laboratoires ont développé de nouvelles polymérases. Quelle caractéristique présente la polymérase Hot-start présentée ?
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La PCR hot-start est inactivée à température ambiante. Elle ne peut donc pas commencer l'élongation avant de démarrer les cycles de PCR (à température ambiante, le risque d'hybridation non spécifique des amorces est élevé). Si on n'a pas de Taq Hot-start, on laisse en permanence son mélange réactionnel dans la glace et on le met au dernier moment dans le thermocycleur.
(inutile de regarder)