Au début d'un cycle de PCR, l'élévation de la température conduit à la dénaturation de l'ADN matrice qui devient alors simple brin.
La diminution de la température à l'étape suivante permet l'hybridation de l'amorce à l'ADN matrice par complémentarité des bases.
MAIS, l'ADN matrice et l'amorce sont chargés négativement ; ils vont donc avoir tendance à se repousser ce qui ne facilite pas l'hybridation !
Les ions K+, chargés positivement, sont attirés par les charges négatives des groupements phosphate. Les charges sont alors neutralisées.
Les ions K+ vont donc affaiblir les forces de répulsion électrostatique. Le complexe ADN matrice - amorce est stabilisé.
Quelle est la conséquence de la stabilisation par K+ ?
seules les hybridations spécifiques sont stabilisées
les hybridations spécifiques et non spécifiques sont stabilisées
seules les hybridations non spécifiques sont stabilisées
En limitant les forces de répulsion électrostatiques, l'hybridation de la sonde à la matrice d'ADN est possible même si l’appariement n'est pas parfait.
Quelle sera la conséquence d'une hybridation non spécifique de la sonde sur la PCR ?
la PCR sera plus efficace
on aura également des amplicons autres que celui recherché
on aura seulement l'amplicon recherché mais en moins grande quantité
Si l'amorce se fixe de manière non spécifique, on risque donc d'avoir une amplification non spécifique et donc l'apparition de bandes "parasites".
Le brin matrice et l'amorce sont maintenus par
des liaisons covalentes
des liaisons électrostatiques
des liaisons hydrogène
Lorsque l'appariement n'est pas parfait, l'association entre les 2 brins
est affaiblie
est renforcée
Si l'appariement n'est pas parfait, il y a moins de liaisons hydrogène entre les 2 brins ; l'association entre les 2 brins est donc affaiblie.
En milieu aqueux, l'ion NH4+ est en équilibre avec l'ammoniac (NH3). Le doublet d'électrons libre de la molécule d'ammoniac va rentrer en compétition avec les bases azotées (en particulier celles qui sont mal appariées) pour former des liaisons hydrogène ce qui déstabilise les brins mal appariés. Les amorces mal appariées vont donc se dissocier du brin matrice.
Seules les hybridations spécifiques résistent.