Mélange réactionnel

Titre de l'activité : Mélange réactionnel

Matériels de l'élève

brouillon

On va réaliser la double digestion des 2 plasmides pGEM-luc (2,5 µg) et pGEX-4T-1 (1µg) avec BamHI et XhoI.

Quantité d'enzyme de restriction

Au laboratoire, la règle est d'utiliser 2 à 3U d'enzyme de restriction par µg d'ADN

Digestion de pGEX-4T-1

Combien d'unités d'enzymes seront-elles nécessaires pour digérer pGEX-4T-1 ?

1 U
3 U
6 U
10 U

Digestion de pGEM-luc

Combien d'unités d'enzymes seront-elles nécessaires pour digérer pGEM-luc ?

1 U
3 U
6 U
10 U

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Volume d'enzymes de restriction

On utilise des enzymes de restriction à la concentration de 3U.µL^-1.

Volume de chaque enzyme pour digérer pGEX-4T-1

De quel volume de chaque enzyme de restriction aura-t-on besoin pour digérer pGEX-4T-1 avec 3U d'enzyme ?

1 µL
2 µL
3 µL

Volume de chaque enzyme pour digérer pGEM-luc

De quel volume de chaque enzyme de restriction aura-t-on besoin pour digérer pGEM-luc avec 6U d'enzyme ?

1 µL
2 µL
3 µL

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Volume total d'enzyme

On réalise les deux digestions en même temps. On ajoute donc les 2 enzymes, BamHI et XhoI dans le mélange réactionnel.

Volume total d'enzyme pour digérer pGEX-4T-1

Quel sera le volume total d'enzyme dans le mélange réactionnel pour digérer pGEX-4T-1 ?

1 µL
2 µL
3 µL
4 µL
5 µL
6 µL

Volume total d'enzyme pour digérer pGEM-luc1

Quel sera le volume total d'enzyme dans le mélange réactionnel pour digérer pGEM-luc ?

1 µL
2 µL
3 µL
4 µL
5 µL
6 µL

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Volume de mélange réactionnel

On peut observer une activité star lorsque la concentration en glycérol dans le mélange réactionnel dépasse 5% (v/v).

Les enzymes de restriction sont conservées dans du glycérol 50% (v/v)

Volume maximum d'enzyme dans le mélange réactionnel

Quel est le volume maximum que les enzymes de restriction peuvent occuper dans le mélange réactionnel pour éviter l'activité star ?

Volume final pour la digestion de pGEX-4T-1

En tenant compte de tous les paramètres précédents, quel devra être le volume minimum du milieu réactionnel pour la double digestion du plasmide pGEX-4T-1 ?

10 µL
20 µL
30 µL
40 µL
50 µL
60 µL

Volume final pour la digestion de pGEM-luc

En tenant compte de tous les paramètres précédents, quel devra être le volume minimum du milieu réactionnel pour la double digestion du plasmide pGEM-luc ?

10 µL
20 µL
30 µL
40 µL
50 µL
60 µL

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Tableau de mélange

Compte-tenu de toutes les informations précédentes, compléter le tableau de composition du mélange réactionnel pour la double digestion des plasmides pGEX-4T-1 et pGEM-luc.

Composition des mélanges réactionnels pour la double digestion
	Quantité ou concentration initiale	Quantité ou concentration finale	Volume pour la digestion de pGEX-4T-1	Volume pour la digestion de pGEM-luc
eau ultrapure	-	-	qsp µL soit µL	qsp µL soit µL
Tampon D	10X	1X	µL	µL
BSA acétylée*	10X	1X	µL	µL
pGEX-4T-1	0,5 µg/µL	1 µg	µL	-
pGEM-luc	0,5 µg/µL	2,5 µg	-	µL
BamHI	3 U/µL	2 à 3 U/µg d'ADN	µL (soit U)	µL (soit U)
XhoI	3 U/µL	2 à 3 U/µg d'ADN	µL (soit U)	µL (soit U)

qsp = quantité suffisante pour

*La BSA n'est pas obligatoire mais stabilise l'enzyme dans le mélange réactionnel

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