Application de le qPCR au diagnostic des maladies virales

Titre de l'activité : Application de le qPCR au diagnostic des maladies virales

Durée : 15-20 min

Pour détecter a posteriori si on a été en contact avec un agent infectieux, on recherche la présence d'anticorps dans le plasma. Mais le développement des anticorps n'est pas immédiat. On peut donc être infecté sans avoir encore produit d'anticorps. La qPCR permet de détecter un ADN viral et de quantifier ce qu'on appelle la charge virale.

Prenons l'exemple du kit de détection Quantivirus^TM SARS-CoV-2 de DIACARTA.

Le SARS-CoV-2 (alias COVID-19) est un virus à ARN enveloppé.

Le kit recherche au cours d'une même qPCR 3 gènes du COVID-19 (gènes N, Orf1ab et E).

Génome du COVID-19 et gènes cibles de la qPCR

La composition du kit est la suivante :

Composition du Kit Quantivirus SARS-CoV-2

Vérifier l'efficacité de la réaction

Vérifier l'aspect d'un échantillon humain non infecté

Vérifier l'absence de contamination

Plus d'éléments à catégoriser

Contrôle négatif d'extraction

Déposez ici

Contrôles positifs

Déposez ici

Contrôle sans échantillon

Déposez ici

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Rôle de l'amplification de RNase P

Le kit amplifie aussi le gène humain de la RNase P. Quel est l'intérêt de cette amplification ?

Choix attendu

vérifier qu'il s'agit d'un virus humain
s'assurer que l'extraction d'ARN préalable a bien fonctionné
Écouler le stock d'amorces

Il est nécessaire de s'assurer que l'extraction d'ARN préalable à la qPCR a bien fonctionné ; cela permet de valider un résultat négatif sinon, en cas de résultat négatif, on ne peut pas savoir si c'est parce qu'on n'a pas réussi à extraire l'ADN ou parce qu'il n'y a pas de virus (voir TP PCR multiplexe de B2BTK)

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Rôle de la sonde

Quel est le rôle des sondes ajoutées aux amorces ?

Choix attendu

C'est la même chose
Empêcher l'emballement de la réaction d'élongation
Permettre la détection spécifique de l'amplification de chaque gène

Les sondes sont couplées à un fluorophore associé à un extincteur de fluorescence (quencher). Elles vont se fixer sur des séquences spécifiques de chacun des gènes recherchés. Quand la polymérase arrive à leur niveau, elle les hydrolyse grâce à son activité exonucléase 5'-3' ; le fluorophore et le quencher s'éloignent alors l'un de l'autre et une fluorescence est émise. En utilisant un fluorophore différent pour chaque gène, on peut quantifier séparément chacun des gènes.

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Amplification

La programmation du thermocycleur est la suivante :

* La détection se fait à la fin de la phase à 60°C

Quel est le rôle de la première étape à 55°C ?

Choix attendu

rétro-transcrire l'ARN (viral) en ADN
pré-hybrider les sondes
activer l'ADN polymérase

Le coronavirus est un virus à ARN ; pour pouvoir le détecter, il faut au préalable rétro-transcrire l'ARN en ADN complémentaire (grâce à une transcriptase inverse probablement incluse dans le Master mix)

Une étape est manquante lors des 40 cycles d'amplification. Proposer une explication.

Choix attendu

dénaturation et hybridation se font à la même température
Sûrement pas ! La dénaturation sert à séparer les 2 brins d'ADN ; ce n'est donc pas à ce moment que les amorces peuvent s'hybrider
hybridation et élongation se font à la même température
et oui, on n'arrête pas le progrès (on parle de FAST PCR)
élongation et dénaturation se font à la même température
Peu probable, d'autant plus que la détection a lieu à la fin de la phase d'élongation et on nous dit qu'elle se fait à 60°C

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Analyse des résultats

Un test est considéré comme positif si Ct<30. Proposer une interprétation des résultats ci-dessous (les témoins étant validés).

Résultats du test Quantivirus^TM
	gène N	gène Ofr1ab	gène E	gène RNaseP	Conclusion
Patient 1	+	-	-	+	douteux (à refaire)
Patient 2	-	-	-	+	négatif
Patient 3	+	+	+	+	positif
Patient 4	-	-	-	-	à refaire
Patient 5	+	-	+	+	positif

On considère que si 2 tests sur les 3 sont positifs, alors le patient est positif (de même 1 seul essai sur 2 prélèvements différents d'un même patient)

Pour le patient 4, l'extraction préalable n'a visiblement pas marché puisque le témoin humain n'est pas amplifié. On doit donc forcément refaire l'extraction.

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Ici et là, des vidéos reprenant le principe du test de détection du SARS-CoV-2.

Rôle de l'amplification de RNase P

Votre choixChoix attenduRéponse

Rôle de la sonde

Votre choixChoix attenduRéponse

Amplification

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Votre choixChoix attenduRéponse

Analyse des résultats

Choix attendu

Choix attendu

Choix attendu

Choix attendu