Dans cette méthode, on utilise 2 sondes spécifiques de la région à amplifier : l'une marquée avec un fluorophore donneur à l'extrémité 3' et l'autre avec un fluorophore accepteur en 5'. Quand les 2 fluorophores sont proches (moins de 10 nt d'écart), la lumière émise par le fluorophore donneur va exciter le fluorophore accepteur. On parle de transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (FRET = Fluorescence Energy Transfert).
Lorsque les 2 sondes sont éloignées (en solution), on n'observe qu'un bruit de fond fluorescent. Pendant l'étape d'hybridation, les 2 sondes se fixent sur leurs séquences cibles respectives de la région à amplifier (localisées à moins de 10 nt d'écart). La proximité permet le FRET et la fluorescence du fluorophore accepteur peut être détectée. Au cours de l'élongation, la Taq polymérase déplace les sondes qui retournent en solution dans le milieu.