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Etude quantitative des acides nucléiques par spectrophotométrie

Effet de la concentration en ADN sur l'absorbance d'une solution⚓

On réalise un spectre d'absorption de solutions d'ADN de différentes concentrations :

Influence de la concentration de la solution d'ADN sur l'absorbance | Informations[*]

Analyse du document

Que peut-on déduire de l'analyse de ce document ?

  • L'absorbance à 260 nm est d'autant plus importante que la concentration en ADN est élevée

  • L'absorbance à 260 nm est d'autant plus importante que la concentration en ADN est faible

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Rappel : la loi de Beer-Lambert appliquée aux acides nucléiques⚓

Le dosage des acides nucléiques respecte la loi de Beer-Lambert : A = ε.c.l

A

A quoi correspond le paramètre A ?

  • la quantité d'ADN

  • l'absorbance de la solution d'acide nucléique mesurée à 260 nm

  • l'absorbance de la solution d'acide nucléique mesurée à 280 nm

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C

A quoi correspond le paramètre c ?

  • la concentration massique de la solution d'ADN

  • la concentration molaire de la solution d'ADN

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epsilon

A quoi correspond le paramètre ε ?

  • le coefficient d'extinction molaire de l'acide nucléique à 260 nm

  • le coefficient d'extinction massique de l'acide nucléique à 260 nm

  • le coefficient d'extinction molaire de l'acide nucléique à 280 nm

  • le coefficient d'extinction massique de l'acide nucléique à 280 nm

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l

A quoi correspond le paramètre l

  • la longueur d'onde

  • 1 cm

  • la longueur du trajet du faisceau lumineux à travers l'échantillon

  • la longueur du faisceau lumineux

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Concentration en acide nucléique correspondant à 1 unité d'absorbance⚓

Pour un spectrophotomètre conventionnel, les coefficients d'extinction des différents types d'acides nucléiques sont donnés dans le tableau ci-dessous :

Avec un spectrophotomètre classique, le trajet optique est de 1cm.

Compléter la colonne correspondante du tableau.

Le lecteur de plaque Multiskan GO peut être utilisé avec une plaque dite « µdrop » qui permet la lecture de très petits volumes (2 à 10µL) de solutions d'ADN non diluées. Le trajet optique n'est alors plus de 1 cm mais de 0,50 mm.

Compléter la dernière colonne du tableau pour la concentration en acide nucléique correspondant à une lecture au µdrop.

Dosage des acides nucléiques par mesure de l'absorbance à 260 nm

Acide nucléique

Coefficient d'extinction massique à 260 nm

(mL.µg -1.cm-1)

Concentration correspondant à 1 unité d'absorbance à 260 nm (µg/mL)

spectrophotomètre « classique »

Multiskan GO

(µdrop)

ADN double brin

0.020

ADN simple brin

0.030

ARN

0.025

Oligonucléotide

0.033

Selon la loi de Beer-Lambert, A = ε.c.l la concentration massique ρ est proportionnelle à la concentration molaire c donc on peut écrire A = ε.ρ.l avec ∅=[mL.µg-1.cm-1].[µg.mL-1].cm

On a donc :

ρ= A/(ε.l)=1/(0,02×1)=50 µg.mL-1 pour l'ADN double brin avec un spectrophotomètre "classique"

ρ= A/(ε.l)=1/(0,02×0,05)=1000 µg.mL-1 pour l'ADN double brin avec la plaque microdrop

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Renvois & Notes

  • Informations

    http://www.biotek.pt/pt/resources/articles/micro-volume-purity-assessment-nucleid-acids.html

  • Effet de la concentration en ADN sur l'absorbance d'une solution
    • Rappel : la loi de Beer-Lambert appliquée aux acides nucléiques
      • Concentration en acide nucléique correspondant à 1 unité d'absorbance
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